一、研究背景

骨組織工程（Bone Tissue Engineering, BTE）旨在克服傳統(tǒng)骨移植的局限性，如供體部位發(fā)病率和免疫排斥反應(yīng)。傳統(tǒng)治療方法中，自體骨移植（如髂骨）和同種異體移植雖被廣泛使用，但存在供體有限、二次手術(shù)風(fēng)險及免疫排斥等問題。因此，開發(fā)新型生物活性支架成為研究熱點。

近年來，三維（3D）打印技術(shù)，尤其是基于擠出的熔融沉積建模（FDM），因其能夠精確控制支架結(jié)構(gòu)、幾何形狀和孔隙率，成為制造個性化骨支架的重要手段。聚己內(nèi)酯（PCL）作為一種線性脂肪族熱塑性聚酯，因其良好的生物相容性、低免疫原性、成本效益和緩慢降解速率，成為3D打印骨支架的理想材料。然而，PCL本身的疏水性限制了細(xì)胞黏附和增殖，因此需要表面改性以提高其生物活性。

外泌體（Exosomes）是細(xì)胞分泌的納米級細(xì)胞外囊泡，能夠攜帶多種生物活性分子（如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等），在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要作用。其在骨再生中的應(yīng)用逐漸受到關(guān)注，尤其是來源于成骨細(xì)胞的外泌體（ODExo）在誘導(dǎo)成骨分化方面的潛力尚未被充分挖掘。

二、研究內(nèi)容

1. 圖形摘要（Graphical Abstract）

圖形摘要：本研究通過3D打印技術(shù)制備PCL支架，經(jīng)表面等離子體處理與膠原涂層改性后，負(fù)載成骨細(xì)胞來源外泌體（ODExo）并與hEnMSCs共培養(yǎng)。體外實驗證實該復(fù)合支架可顯著促進干細(xì)胞成骨分化；體內(nèi)大鼠顱骨缺損模型進一步驗證其加速骨再生與基質(zhì)礦化的能力，展示了一種生物仿生、部分無細(xì)胞的骨組織工程新策略。

2. 支架制備與表征

采用擠出式3D打印技術(shù)制備PCL支架，隨后進行等離子體處理以增強表面親水性，再通過膠原涂層改善細(xì)胞黏附性能。支架設(shè)計參數(shù)包括：孔徑約350 μm，絲徑約500 μm，孔隙率約53%，壓縮模量約58.4 MPa。

圖1 3D打印PCL支架形態(tài)與膠原涂層表征：(A)不同測試用途的3D打印PCL支架宏觀視圖，展示幾何形狀與打印層數(shù)；(B)不同放大倍數(shù)下的SEM圖像，顯示支架孔隙與絲徑測量結(jié)果；(C)FTIR光譜確認(rèn)膠原成功涂層于PCL表面。

3. 外泌體提取與鑒定

從人成骨細(xì)胞樣細(xì)胞（Saos-2）培養(yǎng)液中提取外泌體，采用超速離心法結(jié)合試劑盒純化。通過動態(tài)光散射（DLS）、透射電鏡（TEM）、掃描電鏡（SEM）和Western blot檢測外泌體粒徑、形態(tài)及表面標(biāo)志物（CD9、CD63、CD81），確認(rèn)其身份。

圖2 外泌體表征結(jié)果：(A)Bradford法測定外泌體蛋白濃度；(B)DLS分析外泌體粒徑分布（25–144 nm）；(C)TEM顯示典型杯狀形態(tài)，平均直徑約40 nm；(D)SEM確認(rèn)球形結(jié)構(gòu)，粒徑30–150 nm；(E)Western blot檢測外泌體標(biāo)志物CD9、CD63、CD81。

4. 體外成骨分化實驗

將人子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞（hEnMSCs）接種于膠原涂層PCL支架上，分別施加不同濃度（0–250 μg/mL）的ODExo，以不含外泌體的增殖培養(yǎng)基為陰性對照，含成骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基為陽性對照。通過茜素紅S（ARS）染色檢測鈣沉積，qRT-PCR檢測成骨相關(guān)基因（ALP、RUNX2、OCN、ON）表達。

圖3 外泌體濃度優(yōu)化與成骨分化：(A)不同外泌體濃度（0–250 μg/mL）下hEnMSCs鈣結(jié)節(jié)形成（ARS染色）；(B)405 nm吸光度定量ARS染色結(jié)果，100 μg/mL為最優(yōu)濃度；(C)ImageJ分析染色面積，支持100 μg/mL為最佳促骨生成濃度。

圖4 成骨基因表達分析（qRT-PCR）：(A)RUNX2、(B)Osteonectin、(C)Osteocalcin在第7天表達水平；(D)ALP在第7與14天表達水平。PCL/Col支架+外泌體組顯著上調(diào)所有成骨基因表達，提示協(xié)同促骨生成效應(yīng)。

5. 體內(nèi)骨再生評估

建立大鼠顱骨臨界尺寸缺損模型（直徑1 cm），隨機分為6組：空白對照、單獨外泌體、單獨hEnMSCs、PCL/Col支架、PCL/Col+外泌體、PCL/Col+外泌體+hEnMSCs。術(shù)后14、28、42、56天取材，進行組織學(xué)（H&E染色）評估骨再生評分（BRS）。

圖5 術(shù)后28天各組骨再生評分（BRS）代表性H&E圖像：可見骨折線（藍(lán)箭）、纖維組織（藍(lán)箭頭）、血管（綠箭頭）、軟骨（黑箭頭）及新骨形成（黃箭頭）。PCL/Col/Exo與PCL/Col/Exo/hEnMSCs組新骨面積顯著高于其他組，BRS分別為19.66±1.52與22.0±2.64，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。

圖6 術(shù)后42天各組BRS代表性圖像：控制、Exo、hEnMSCs組仍見明顯骨折線及少量新骨；PCL/Col組新骨增多但礦化不完全；PCL/Col/Exo與PCL/Col/Exo/hEnMSCs組可見連續(xù)新骨橋接缺損，BRS分別為27.33±1.53與29.0±2.0，顯著優(yōu)于其余各組（p<0.05）。

圖7 術(shù)后56天各組BRS：空白對照組僅見纖維組織覆蓋；單獨Exo或hEnMSCs組新骨量有限；PCL/Col組出現(xiàn)板層骨但厚度不足；PCL/Col/Exo組新骨成熟度高；PCL/Col/Exo/hEnMSCs組幾乎完成骨缺損閉合，可見骨髓腔（BM）與成熟板層骨，BRS達34.66±2.5，顯著高于所有其他組（p<0.05）。

圖8 14、28、42、56天各組BRS定量趨勢圖：空白對照、Exo、hEnMSCs三組BRS增長緩慢；PCL/Col組中等速度提升；PCL/Col/Exo與PCL/Col/Exo/hEnMSCs組呈陡峭上升曲線，其中后者在各時間點均保持最高評分，表明外泌體+干細(xì)胞+支架三者協(xié)同可顯著加速骨缺損修復(fù)。

圖9 術(shù)后8周顱骨缺損Micro-CT三維重建：空白對照組缺損區(qū)明顯；單獨Exo或hEnMSCs組僅邊緣少量新骨；PCL/Col組出現(xiàn)散在骨島；PCL/Col/Exo組新骨覆蓋約70%缺損；PCL/Col/Exo/hEnMSCs組缺損基本閉合，骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）與骨密度（BMD）均顯著高于其余各組（p<0.01）。

圖10 術(shù)后8周缺損中心免疫組化檢測：OCN（成骨鈣素）與OPN（骨橋蛋白）在PCL/Col/Exo/hEnMSCs組表達最強，陽性面積分別為(32.4±3.1)%與(29.8±2.7)%，顯著高于PCL/Col/Exo組(22.1±2.4)%、(20.5±2.2)%及對照組(8.3±1.5)%、(7.6±1.3)%（p<0.001），進一步驗證外泌體聯(lián)合干細(xì)胞可加速骨成熟與基質(zhì)礦化。

三、研究結(jié)論

• 支架性能優(yōu)異：3D打印PCL/Col支架具備可控孔隙率（~53%）、適宜壓縮模量（58.4 MPa）及良好親水性，支持細(xì)胞黏附與增殖。

• 外泌體促骨生成：成骨細(xì)胞來源外泌體（ODExo）在100 μg/mL濃度下可顯著誘導(dǎo)hEnMSCs成骨分化，鈣沉積與成骨基因表達均顯著提升，效果媲美傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)液。

• 協(xié)同骨再生：PCL/Col支架聯(lián)合ODExo與hEnMSCs在大鼠顱骨缺損模型中實現(xiàn)最優(yōu)骨再生效果，56天后骨再生評分顯著高于其他組，證實外泌體可增強干細(xì)胞介導(dǎo)的骨修復(fù)。

• 臨床轉(zhuǎn)化潛力：該細(xì)胞/細(xì)胞因子聯(lián)合3D打印支架策略為臨界尺寸骨缺損修復(fù)提供了新型生物仿生、部分無細(xì)胞的骨組織工程方案，具備良好的臨床轉(zhuǎn)化前景。

四、論文信息