一、研究背景

骨軟骨（OC）缺損由創(chuàng)傷、退行性關(guān)節(jié)疾病或感染引發(fā)，因同時(shí)涉及關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨，是骨科領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。軟骨無(wú)血管的特性以及骨軟骨界面復(fù)雜的生物力學(xué)特征，嚴(yán)重限制了機(jī)體自身的修復(fù)機(jī)制，常導(dǎo)致疼痛、功能障礙，甚至發(fā)展為骨關(guān)節(jié)炎。

當(dāng)前的臨床策略，如微骨折、自體移植/異體移植以及細(xì)胞療法等，均未能實(shí)現(xiàn)骨軟骨修復(fù)所需的結(jié)構(gòu)與功能整合，無(wú)法達(dá)成持久修復(fù)的效果，因此迫切需要?jiǎng)?chuàng)新的解決方案。傳統(tǒng)的骨軟骨修復(fù)支架策略，例如模擬軟骨和骨層的雙層設(shè)計(jì)，往往存在力學(xué)不匹配、界面整合性差以及孔隙梯度不合理等問(wèn)題，進(jìn)而導(dǎo)致載荷傳遞不佳和細(xì)胞浸潤(rùn)受限。

天然生物材料雖具有生物相容性和類(lèi)細(xì)胞外基質(zhì)特性，但在承重區(qū)域面臨降解速度快、機(jī)械穩(wěn)定性不足等局限；合成聚合物和陶瓷材料雖可調(diào)節(jié)降解性能和強(qiáng)度，卻存在生物惰性，需要進(jìn)行表面修飾或添加生長(zhǎng)因子。組織工程學(xué)致力于開(kāi)發(fā)能夠仿生復(fù)制天然骨軟骨組織層級(jí)結(jié)構(gòu)和生化信號(hào)的支架，為解決這一難題提供了變革性思路。

二、研究?jī)?nèi)容

（一）材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料：采用聚乙烯醇（PVA）、甘油（GC）、kartogenin（KGN）、納米羥基磷灰石（nHA）、75%乙醇以及聚環(huán)氧乙烷（PEO）作為生物墨水成分，所有材料均未經(jīng)過(guò)進(jìn)一步純化處理。

2. 3D打印墨水制備：

• 納米多孔層水凝膠（NPH）：將2g PVA與不同濃度（0-100μM）的KGN溶解在18.0g GC/水二元溶液（質(zhì)量比1:1）中，在95℃攪拌至PVA完全溶解，靜置去除氣泡。

• 分層多孔層水凝膠（HPH）：先將2g PVA、0.4g PEO溶解在18.0g GC/水二元溶液（質(zhì)量比1:1）中，再加入不同含量（0-30wt%）的nHA，95℃攪拌至完全溶解，靜置30分鐘去除氣泡，倒入矩形玻璃模具，-20℃放置1小時(shí)制備樣品。

3. 3D打印過(guò)程：使用自制3D打印機(jī)（噴嘴直徑250μm）打印NPH、HPH和THMH支架。THMH支架經(jīng)一步凍融循環(huán)（-20℃ 6小時(shí)，25℃ 4小時(shí)）和75%乙醇處理2小時(shí)，去除PEO和過(guò)量甘油，得到最終支架。

4. 表征方法：通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）、光學(xué)顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、X射線衍射（XRD）、動(dòng)態(tài)流變分析、拉伸、壓縮、彎曲及循環(huán)拉伸測(cè)試等對(duì)支架的形貌、結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能進(jìn)行表征。

5. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），通過(guò)CCK-8法、活死細(xì)胞染色評(píng)估支架生物相容性；采用堿性磷酸酶（ALP）染色、茜素紅（AR）染色、實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、免疫熒光染色等檢測(cè)支架對(duì)BMSCs成骨和成軟骨分化的影響；進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析差異表達(dá)基因及相關(guān)信號(hào)通路。

6. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將64只6-8周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組（NPH、HPH、THMH和空白組），在股骨髁建立骨軟骨缺損模型（直徑2mm×深度3mm），植入相應(yīng)支架或不做處理。術(shù)后6周和12周處死大鼠，通過(guò)大體觀察、Micro-CT掃描、組織學(xué)染色（HE、番紅O-固綠、免疫組織化學(xué)、免疫熒光染色）、序列熒光染色等評(píng)估骨軟骨修復(fù)效果；進(jìn)行有限元分析評(píng)估生物力學(xué)性能；檢測(cè)主要器官組織評(píng)估體內(nèi)生物相容性。

（二）核心研究設(shè)計(jì)

本研究開(kāi)發(fā)了一種拓?fù)浞謱訖C(jī)械水凝膠（THMH）支架，采用集成3D打印技術(shù)，具有仿生雙層結(jié)構(gòu)，能夠模擬天然骨軟骨微環(huán)境。該支架整合了納米多孔軟骨模擬層和大孔成骨層，通過(guò)梯度孔隙相互連接，以促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸、血管形成和細(xì)胞間通訊。

PVA被選為支架基質(zhì)，因其具有良好的生物相容性、可調(diào)節(jié)的物理交聯(lián)特性和靈活的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)控制能力。THMH的力學(xué)異質(zhì)結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了無(wú)縫的力學(xué)過(guò)渡，類(lèi)似天然骨軟骨界面，其納米孔（85±28nm）用于營(yíng)養(yǎng)交換和生長(zhǎng)因子保留，大孔（324±37μm）用于細(xì)胞遷移和血管形成。

圖1. THMH用于加速骨軟骨再生的集成3D打印示意圖

（三）關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. 結(jié)構(gòu)與力學(xué)性能：SEM圖像顯示THMH具有層級(jí)多孔結(jié)構(gòu)，界面結(jié)合牢固；FTIR和XRD證實(shí)KGN和nHA成功整合到支架中；動(dòng)態(tài)力學(xué)分析表明納米多孔層具有更高的儲(chǔ)能模量和損耗模量；力學(xué)測(cè)試顯示THMH具有良好的彈性、拉伸強(qiáng)度（1.9±0.3MPa）、斷裂伸長(zhǎng)率（308±27%）和抗疲勞性能，在100次循環(huán)拉伸后仍保留90.6%的原始強(qiáng)度。

圖2. （A）THMH集成3D打印的數(shù)字照片；（B）THMH的垂直截面SEM照片；（C）（B）的放大SEM照片；（D）（B）的放大SEM照片；（E，F(xiàn)）3D打印NPH的表面SEM照片；（G，H）3D打印HPH的表面SEM照片；（I）彎曲、拉伸和扭轉(zhuǎn)過(guò)程中的數(shù)字照片；（J）納米多孔層、分層多孔層和THMH的FTIR曲線；（K）納米多孔層、分層多孔層和THMH的XRD曲線；（L）NPH、HPH和THMH的儲(chǔ)能模量和損耗模量

圖3. （A）KGN釋放標(biāo)準(zhǔn)曲線；（B）24天的KGN長(zhǎng)期釋放測(cè)試；（C）KGN負(fù)載效率；（D）NPH、HPH和THMH不同水凝膠的溶脹率；（E）NPH、HPH和THMH的孔隙率；（F）NPH、HPH和THMH的應(yīng)力-應(yīng)變曲線；（G）NPH、HPH和THMH的應(yīng)力-應(yīng)變曲線；（H）NPH、HPH和THMH的強(qiáng)度；（I）NPH、HPH和THMH的壓縮模量

2. 體外生物性能：CCK-8法和活死細(xì)胞染色證明THMH具有優(yōu)異的生物相容性；Alcian藍(lán)染色、RT-PCR和免疫熒光染色顯示NPH層能顯著促進(jìn)BMSCs成軟骨分化，抑制軟骨肥大分化；ALP染色、AR染色、RT-PCR和免疫熒光染色表明HPH層可有效促進(jìn)BMSCs成骨分化。

圖4. （A）BMSCs與NPH、HPH和THMH共培養(yǎng)1、4或7天的CCK-8測(cè)定；（B）不同水凝膠共培養(yǎng)7天后，用鈣黃綠素-AM（活細(xì)胞，綠色熒光）和PI（死細(xì)胞，紅色熒光）染色的BMSCs的CLSM圖像（比例尺100μm）；（C）第7天的ALP染色和ALP活性測(cè)量（比例尺100μm，***p<0.001）；第14天的茜素紅染色（ARS）和定量分析（比例尺200μm，***p<0.001）；（D）第14天各組BMSCs的成骨基因表達(dá)（OPN、OCN、RUNX2和BMP2）（***p<0.001）；（E）第14天的阿爾新藍(lán)染色和定量分析（比例尺100μm，***p<0.001）；（F）第14天各組BMSCs的軟骨相關(guān)基因表達(dá)（AGG、SOX9、COLII和MMP13）（***p<0.001）

3. 轉(zhuǎn)錄組分析：NPH組差異表達(dá)基因富集于機(jī)械刺激響應(yīng)、細(xì)胞增殖遷移粘附正調(diào)控、細(xì)胞外基質(zhì)組織及PI3K-AKT信號(hào)通路，提示其通過(guò)力學(xué)性能和KGN激活整合素-PI3K-AKT信號(hào)軸促進(jìn)成軟骨分化；HPH組差異表達(dá)基因富集于細(xì)胞粘附增殖、細(xì)胞外基質(zhì)組織、缺氧響應(yīng)及BMP信號(hào)通路，其層級(jí)多孔結(jié)構(gòu)改善了內(nèi)部缺氧環(huán)境，促進(jìn)成骨分化。

圖7. （A）在軟骨分化培養(yǎng)基中，在NPH和組織培養(yǎng)板上培養(yǎng)的BMSCs中所有差異表達(dá)基因（DEGs）的GO分析；（B）NPH組DEGs的火山圖；（C）在成骨分化培養(yǎng)基中，在HPH和組織培養(yǎng)板上培養(yǎng)的BMSCs中所有DEGs的GO分析；（D）HPH組DEGs的火山圖；（E）PI3K-AKT信號(hào)通路的富集圖；（F）缺氧響應(yīng)的富集圖

4. 體內(nèi)修復(fù)效果：

• 大體觀察：術(shù)后12周，THMH組實(shí)現(xiàn)幾乎完全的軟骨缺損修復(fù)，再生軟骨顏色正常，與周?chē)浌钦狭己?，表面光滑；ICRS評(píng)分顯著高于其他組，Goebel評(píng)分顯著低于其他組。

• Micro-CT：THMH組軟骨下骨修復(fù)效果良好，骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）顯著高于對(duì)照組和NPH組，骨小梁分離度（Tb.Sp）顯著降低。

• 組織學(xué)分析：THMH組術(shù)后12周形成類(lèi)透明軟骨，關(guān)節(jié)表面光滑，組織形態(tài)連續(xù)，軟骨下骨完全重塑，與相鄰組織高度匹配；AGG、COL II、Runx2、BMP2等相關(guān)蛋白表達(dá)顯著高于其他組。

• 序列熒光染色：HPH和THMH組新骨形成量多、生長(zhǎng)速度快。

• 有限元分析：THMH組應(yīng)力分散均勻，能有效將載荷傳遞至軟骨下骨，與未填充缺損組相比，應(yīng)力集中減少86-89%。

• 體內(nèi)生物相容性：支架植入后無(wú)明顯炎癥反應(yīng)，對(duì)主要器官無(wú)損傷。

圖5. （A）術(shù)后6和12周，不同組修復(fù)的大鼠軟骨缺損的大體觀察、ICRS和Goebel評(píng)分（比例尺1mm）；（B）術(shù)后6和12周，不同組修復(fù)的軟骨缺損的番紅O-固綠染色（比例尺500μm，放大圖100μm）；（C）術(shù)后6和12周，SD大鼠股骨髁的橫斷、矢狀和冠狀面的3D重建和2D重建的Micro-CT圖像（比例尺2mm）；（D）基于Micro-CT圖像的骨軟骨修復(fù)模型中形成的BV/TV、Tb.N、Tb.Th評(píng)分和Tb.Sp評(píng)分的半定量分析（****p<0.001）

圖6. （A）術(shù)后6和12周，各組骨軟骨缺損處軟骨再生標(biāo)志物AGG和COL II（比例尺100μm）以及骨再生標(biāo)志物RUNX2和BMP2（比例尺500μm）的免疫組織化學(xué)染色；（B）四組中AGG、COL II、RUNX2和BMP2的IHC染色陽(yáng)性染色區(qū)域的比較；（C）術(shù)后4和8周，各組軟骨下骨缺損部位新形成骨組織的共聚焦熒光圖像和熒光強(qiáng)度的定量分析（比例尺：500μm）；（D）治療12周后，對(duì)照組和THMH組在不同彎曲力（0°和90°）加載下，種植體周?chē)堑鸟T·米塞斯應(yīng)力分布；（E）四組中AGG、COL II、RUNX2和BMP2的IHC染色陽(yáng)性染色區(qū)域的比較

三、研究結(jié)論

四、論文信息

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