一、研究背景

在骨再生領(lǐng)域，近年來研究焦點(diǎn)集中在通過3D打印技術(shù)制備具有理想孔隙率、形狀和尺寸的個(gè)性化支架，這類支架能夠有效促進(jìn)組織再生進(jìn)程。陶瓷支架因相比聚合物等其他材料更接近天然骨的原生結(jié)構(gòu)，成為骨再生的主要選擇。硅基材料憑借其成骨性能、生物活性以及促進(jìn)細(xì)胞歸巢和分化的能力，受到廣泛研究關(guān)注。與磷酸鈣等其他陶瓷材料相比，硅還具有釋放硅離子帶來的血管生成和成骨特性，且其介孔結(jié)構(gòu)更易控制，可實(shí)現(xiàn)治療分子的包封和釋放。

然而，純硅材料存在兩大顯著缺陷：脆性大且缺乏降解性。為解決這些問題，研究人員嘗試將硅與有機(jī)化合物結(jié)合制備3D打印支架。此前已開發(fā)的多種3D可打印硅基復(fù)合材料，通過將硅融入熔融聚合物、可打印光聚合物或生物聚合物基質(zhì)中，在一定程度上改善了降解性和脆性，但這些方法普遍存在局限性，如熔融溫度導(dǎo)致藥物包封受限、硅顆粒易造成擠出系統(tǒng)堵塞從而降低硅含量、光聚合物基質(zhì)中顆粒團(tuán)聚引發(fā)紫外散射、硅與基質(zhì)間無化學(xué)鍵合以及聚合物基質(zhì)降解過快等。

近期，具有無機(jī)和有機(jī)組分共網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的3D打印雜化墨水被認(rèn)為是克服硅基復(fù)合材料缺陷的有效途徑。這類硅雜化材料通常在溫和溫度下通過溶膠-凝膠反應(yīng)制備，即硅前驅(qū)體先水解，再通過溫度或pH值調(diào)節(jié)進(jìn)行凝膠化。但目前通過該方法制備的硅基雜化材料所使用的聚合物缺乏對(duì)細(xì)胞黏附至關(guān)重要的RGD序列。因此，使用含RGD序列的明膠作為聚合物，有望增強(qiáng)骨再生效果。為實(shí)現(xiàn)明膠與硅網(wǎng)絡(luò)的化學(xué)結(jié)合，3-縮水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）已被用作交聯(lián)劑，與正硅酸乙酯（TEOS）作為主要硅前驅(qū)體配合使用。不過，此前相關(guān)研究的配方中明膠占比高于硅，這可能限制支架在骨再生應(yīng)用中的生物活性?；谏鲜鲅芯楷F(xiàn)狀，本研究旨在開發(fā)一種硅含量高于聚合物的硅-明膠雜化墨水，以充分發(fā)揮硅的生物活性和血管生成特性。

二、研究內(nèi)容

（一）實(shí)驗(yàn)材料與方法

1. 材料準(zhǔn)備：實(shí)驗(yàn)所用試劑除特殊說明外均購自Sigma-Aldrich。主要材料包括正硅酸乙酯（TEOS）、鹽酸（37% HCl）、3-縮水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）、明膠（A型，來自豬皮）等。

2. 墨水研發(fā)：

• 初始溶膠制備：混合TEOS、GPTMS、0.1 M HCl和蒸餾水，TEOS:GPTMS體積比在9:1至5:5之間，水/TEOS摩爾比固定為8，在密封玻璃容器中以700 rpm攪拌至形成均勻溶液。

• 純硅墨水制備：作為對(duì)照，采用相同水/TEOS比例，不含GPTMS，按照先前描述的方法在60°C水浴中加熱至具有可打印黏度。

• 雜化墨水制備：在35°C水中制備20% w/v明膠溶液，用1 M HCl將明膠pH值調(diào)節(jié)至4.5、5.0和5.5以控制膠凝速度（pH高于5.5時(shí)墨水凝膠化過快，小于30分鐘即無法打印）。隨后在35°C下，將溶膠與明膠按1:1或0.5:1的體積比例混合，以500 rpm攪拌至開始凝膠化，再轉(zhuǎn)移至注射器中在35°C下繼續(xù)凝膠化反應(yīng)。

• 命名規(guī)則：TEOS:GPTMS比例以“T+TEOS占比”表示，明膠:溶膠比例以“G+明膠占比”表示，如TEOS:GPTMS=8:2且明膠:溶膠=0.5:1的條件命名為“T8-G0.5”，pH值非4.5時(shí)在名稱后注明。

3. 形狀保真度與收縮率測試：依據(jù)既定方案進(jìn)行融合率（Dfr）、可打印性（Pr）和坍塌率（C）測試，并對(duì)比支柱寬度與理論值。使用Direct-Writing 3D打印機(jī)（Bio X, Cellink），打印速度4 mm/s，擠出速度2.50 μl/s，噴嘴直徑0.58 mm。形狀保真度測試做五組重復(fù)，支柱寬度測試做三組重復(fù)。

4. 支架3D打印：采用DIW直寫生物3D打印機(jī)，使用選定墨水進(jìn)行打印，參數(shù)為噴嘴0.58 mm、擠出速度250 μL/s、回縮體積25 μL、打印速度4 mm/s。打印后的支架密封在密閉容器中，室溫下熟化7天以完成溶膠-凝膠反應(yīng)，隨后進(jìn)行冷凍干燥。

5. 力學(xué)性能測試：使用機(jī)電測試機(jī)（Z5, Zwick）對(duì)15×15×10 mm3的支架進(jìn)行單軸壓縮試驗(yàn)。樣品干燥后在37°C水中浸泡24小時(shí)，用千分尺測量尺寸，隨后以1 mm/min的變形速度進(jìn)行破壞測試，記錄應(yīng)力，評(píng)估彈性模量（E）、最大力和破壞應(yīng)變。

6. 理化特性表征：

• 吸水率測試：將10×10×2.5 mm3的支架浸泡在37°C的1×PBS中24小時(shí)，按公式ΔWs(%)=(Ws-W0)/W0×100計(jì)算吸水率（W0為初始重量，Ws為最終重量）。

• 降解測試：支架在37°C的1×PBS中浸泡21天，定期清洗、冷凍干燥并稱重，按公式ΔWd(%)=(W0-Wd)/W0×100計(jì)算降解率（W0為初始干重，Wd為最終干重）。

• 明膠釋放測試：支架在37°C的1×PBS中浸泡21天，分別在1、7、14和21天取出溶液并更換新鮮PBS，采用CBQCA分析法（Invitrogen）定量釋放的明膠量。

7. 體外磷灰石形成測試：采用模擬體液（SBF）浸泡法，將6×6×1.5 mm3的支架經(jīng)紫外線滅菌后放入含15 mL SBF的容器中，三組重復(fù)。在3、7、14和21天后，取出支架清洗、風(fēng)干并真空干燥24小時(shí)，通過掃描電子顯微鏡（SEM）和能量色散光譜（EDS）觀察磷灰石形成及鈣、磷元素存在情況。

8. 體外細(xì)胞毒性測試：制備與支架類似的薄膜（200 μL墨水注入5 mm圓形模具），經(jīng)70%乙醇滅菌5分鐘和紫外線滅菌15分鐘后，用無菌1%明膠在37°C振蕩孵育以封閉未反應(yīng)的GPTMS，隨后用培養(yǎng)基浸泡過夜。將大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞（rMSCs）接種到薄膜上，在特定培養(yǎng)基和5% CO?環(huán)境中培養(yǎng)，分別在1天和7天后通過dsDNA定量（Quant-iT?PicoGreen?, Invitrogen）評(píng)估細(xì)胞附著和增殖情況。

9. 體外3D增殖與免疫組織化學(xué)測試：使用12×12×2.5 mm3的支架，經(jīng)滅菌和明膠處理后，接種150,000個(gè)細(xì)胞，加入500 μL培養(yǎng)基。在1、3和7天后裂解支架并定量細(xì)胞數(shù)。培養(yǎng)7天后，通過共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，采用鬼筆環(huán)肽（acti-Stain 488 phalloidin）和DAPI染色分別標(biāo)記細(xì)胞骨架和細(xì)胞核。

10. 統(tǒng)計(jì)分析：先驗(yàn)證數(shù)據(jù)的正態(tài)分布和方差齊性，再采用參數(shù)檢驗(yàn)（單因素方差分析，One-Way ANOVA）或非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney U檢驗(yàn)和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)）進(jìn)行組間比較，p<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有分析使用MiniTab 17軟件（Minitab Inc.）進(jìn)行。

（二）關(guān)鍵研究結(jié)果

1. 墨水研發(fā)結(jié)果：在35°C下進(jìn)行溶膠-凝膠反應(yīng)以維持明膠液態(tài)，GPTMS濃度限制在硅前驅(qū)體的50%以內(nèi)（考慮其潛在細(xì)胞毒性）。通過篩選不同配方，獲得四種可打印墨水：T8G1、T8G0.5、T7G1和T7G1-5.0，其中前三者pH為4.5，T7G1-5.0 pH為5.0，TEOS:GPTMS比例在7:3–8:2之間，明膠與溶膠比例分別為1:1或0.5:1。

圖2 不同明膠pH值和TEOS:GPTMS體積比下的可打印條件：a 溶膠:明膠體積比1:1；b 溶膠:明膠體積比1:0.5。x表示5小時(shí)內(nèi)不凝膠；打印窗口<30分鐘；打印窗口≥30分鐘

2. 形狀保真度與收縮率：

• 融合率：隨孔徑增大逐漸降低，1×1 mm2的小孔融合率達(dá)100%（無法分辨）；pH 4.5的墨水在孔徑≥3 mm時(shí)融合率低于50%；T7G1-5.0墨水在多數(shù)孔徑下融合率顯著更低，2 mm孔徑時(shí)低于50%，大孔徑時(shí)低于20%，更利于精細(xì)打印小結(jié)構(gòu)。

• 可打印性：所有墨水的值接近1，表明打印形狀接近理論正方形；pH 4.5的墨水值略高于1（呈鋸齒狀打印），T7G1-5.0（pH 5.0）值略低于1但接近理想值（打印支柱更直），推測pH是影響交聯(lián)程度的主要因素。

• 坍塌率：所有條件下均極低，1和2 mm支柱間距時(shí)可忽略，所有條件下均低于20%，表明墨水能有效橋接間隙并形成清晰層狀結(jié)構(gòu)。

• 支柱寬度與收縮：所有墨水打印的支柱寬度均顯著大于理論值（0.58 mm），T7G1-5.0形狀保真度最佳，支柱寬度僅比理論值大22%；所有條件在x-y平面收縮約35–40%，z-y平面收縮約40–45%，明膠的加入降低了收縮率（純硅收縮約62%）。

圖3 不同墨水的形狀保真度評(píng)估：a 融合率；b 可打印性；c 坍塌率

3. 支架3D打印效果：所有打印支架呈白色半透明狀，T7G1-5.0為均勻白色且不透明；T7G1-5.0的支柱均勻呈圓柱形，其他三種墨水的支柱長度方向?qū)挾炔痪输忼X狀路徑；SEM圖像顯示T7G1-5.0表面粗糙，其他三種表面較光滑且因支柱不均勻存在可見褶皺。

圖4 3D打印支架（15×15×3 mm3）及其SEM表面圖像

4. 力學(xué)性能：純硅支架力學(xué)性能較低，應(yīng)力-應(yīng)變曲線呈鋸齒狀（壓縮過程中存在微斷裂）；雜化墨水支架的脆性降低，所有雜化墨水的極限拉伸強(qiáng)度顯著提高（p<0.05），明膠和GPTMS含量較高的墨水破壞應(yīng)變更大（p<0.05）。T8系列配方應(yīng)力較高，但仍保留鋸齒狀曲線；T7系列（尤其是T7G1-5.0）應(yīng)力-應(yīng)變曲線呈線性響應(yīng)，彈性區(qū)域更大，塑性行為更顯著，應(yīng)力和變形能力顯著提高，推測與更高的交聯(lián)劑含量及pH 5.0更利于明膠交聯(lián)有關(guān)。

表3 支架力學(xué)性能總結(jié)：彈性模量（E）、最大力和破壞應(yīng)變

5. 理化特性：

• 吸水率：所有雜化支架24小時(shí)吸水率較純硅支架顯著提高（4-8倍），T8系列約為50%，T7系列更高（T7G1為72%，T7G1-5.0為80%），歸因于明膠的高保水能力及交聯(lián)劑含量對(duì)明膠保留的影響。

• 降解率：純硅支架21天降解率僅2.5%，雜化支架降解率在4%-13.5%之間，明膠含量越高降解率越高；T7G1-5.0降解率高于預(yù)期，推測與pH 5.0下明膠分布更均勻有關(guān)。

• 明膠釋放：T8G1在最初24小時(shí)內(nèi)明膠爆發(fā)式釋放，T8G0.5釋放量較低，T7系列釋放相對(duì)平緩。

圖5 不同墨水打印支架的理化特性分析：b 24小時(shí)吸水率；c 21天降解率；d 不同時(shí)間點(diǎn)明膠釋放量。A、B、C組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（p<0.05）

6. 體外磷灰石形成：純硅支架和T8G1在SBF中浸泡7天后開始沉積磷灰石，其他三種雜化支架3天即開始沉積，7天幾乎完全覆蓋；EDS分析證實(shí)沉積物含鈣和磷離子。較高明膠含量延遲磷灰石沉積，GPTMS可能對(duì)磷灰石形成有積極作用。

圖6 體外磷灰石形成測試：支架在37°C SBF中浸泡3天和7天的磷灰石沉積情況。a T8G1：7天開始沉積，3天無沉積；b T8G0.5：3天和7天均有沉積；c T7G1：3天和7天均有沉積；d T7G1-5.0：3天和7天均有沉積；e 純硅：7天開始沉積，3天無沉積；f EDS分析證實(shí)鈣和磷離子存在

7. 體外細(xì)胞毒性：第1天所有配方的細(xì)胞數(shù)量相近（T7G1顯著較低，p<0.05）；第7天T8系列細(xì)胞數(shù)量增加，T7系列略有減少（推測與GPTMS的潛在細(xì)胞毒性有關(guān)，未完全中和的環(huán)氧基團(tuán)可能影響細(xì)胞活力）；組織培養(yǎng)塑料（TCP）對(duì)照組細(xì)胞增殖最佳。

圖7 通過評(píng)估薄膜上細(xì)胞裂解物的DNA濃度分析雜化薄膜的細(xì)胞毒性（第1天和第7天）。*與T8G1相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）

8. 體外3D增殖與免疫組織化學(xué)：T8G1的初始細(xì)胞黏附顯著高于純硅支架（p<0.05），T8G0.5與純硅無顯著差異；第7天所有組細(xì)胞數(shù)量均顯著增加，純硅支架細(xì)胞數(shù)量翻倍，雜化支架增至三倍。免疫熒光圖像顯示雜化支架細(xì)胞覆蓋率更高，細(xì)胞分布均勻且形態(tài)扁平、有多個(gè)細(xì)胞骨架延伸，表明細(xì)胞與支架結(jié)合牢固。

圖8 硅-明膠雜化3D打印支架的增殖情況：a 培養(yǎng)1、3和7天的支架DNA定量；b 培養(yǎng)7天的純硅和雜化支架免疫熒光圖像（鬼筆環(huán)肽染色呈綠色，DAPI染色呈藍(lán)色）。*與純硅支架相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）

三、研究結(jié)論

本研究通過溶膠-凝膠反應(yīng)，以TEOS為硅前驅(qū)體、明膠為有機(jī)組分、GPTMS為交聯(lián)劑，在溫和溫度和pH催化下，成功開發(fā)出四種硅-明膠雜化墨水（T8G1、T8G0.5、T7G1和T7G1-5.0）。所有墨水均具有良好的可打印性和形狀保真度（低融合率、高橋接能力），且硅為主要相。

與純硅支架相比，雜化支架在各方向收縮均勻，溶脹性、降解性和力學(xué)性能均得到改善：所有雜化支架的最大力均有所提高，變形能力（破壞應(yīng)變）隨GPTMS和明膠含量增加而增強(qiáng)。盡管明膠的加入曾被認(rèn)為可能限制支架生物活性，但雜化支架的磷灰石沉積未受負(fù)面影響。

在生物響應(yīng)方面，GPTMS含量較高的T7G1和T7G1-5.0因潛在的GPTMS相關(guān)毒性，無法支持細(xì)胞增殖；而T8G1和T8G0.5能有效促進(jìn)細(xì)胞增殖，增強(qiáng)初始細(xì)胞黏附，7天后細(xì)胞數(shù)量較純硅支架接近三倍。

總體而言，該硅-明膠雜化材料保留了硅的優(yōu)勢，同時(shí)通過改善理化性能、力學(xué)性能和生物性能，克服了純硅材料的局限性。此外，溫和的制備工藝使其有望整合生物活性分子，為未來骨再生應(yīng)用開辟了新的可能性。

四、論文信息